SRP om placental associeret malaria (PAM) | Kemi A og Bioteknologi A

  • STX 3.g
  • SRP (Kemi A, Bioteknologi A)
  • 12
  • 46
  • 9596
  • PDF

SRP om placental associeret malaria (PAM) | Kemi A og Bioteknologi A

Studieretningsprojekt (SRP) i Kemi A og Bioteknologi A, som beskæftiger sig med to forskellige metoder inden for bekæmpelse af malaria. SRP'et indeholder en redegørelse af malaria parasittens livscyklus, efterfulgt af en redegørelse for nogle af de medikamenter, som bruges til at behandle malaria. Derefter diskuterer opgaven, hvorvidt medikamenter er en tilstrækkelig behandlingsmetode, da mange mennesker, som lever i udsatte områder, ikke har råd til behandling.

SRP'et beskæftiger sig også med metoden at udvikle en vaccine. Her fokuseres på en vaccine mod pregnancy associated malaria (PAM). Opgaven indeholder en diskussion af fordelene og ulemperne ved en vaccine mod malaria, hvor konklusionen er, at en udryddelse af malaria vil kræve mange midler, som kun kan komme fra de vestlige lande. Men samtidig også at effekterne af dette kan være store.

Til slut redegøres der for, hvordan man producerer antigener, samt hvordan man oprenser disse, og en forklaring til nogle af metoderne bag.

Opgaveformulering

Du skal redegøre for sygdommen malaria og for udvalgte midler mod malaria, hvor du fokuserer på kemisk opbygning og egenskaber hvor det er relevant. Diskuter virkning samt udfordringer inden for forebyggelse og behandling af malaria.

Redegør for hvordan en vaccine mod pregnancy associated malaria (PAM) virker, herunder skal du komme ind på proteinstrukturen af VAR2CSA og udviklingen af vaccinen.

Redegør for den overordnede procedure for fremstillingen af PAM-vaccinekandidaten. I den forbindelse skal du grundigt forklare kemien og bioteknologien bag udvalgte teknikker.

Analyser resultaterne fra forsøgene fra "Immunologisk lægemiddeludvikling - Kuren mod malaria" Diskuter fordele, ulemper og perspektiver ved PAM-vaccinen.

Studienets kommentar

Du kan også få hjælp til dit Studieretningsprojekt i SRP-bogen. Her guider vi dig i alt fra emnevalg og faglige metoder til opbygning af opgaven.
Få den bedste hjælp til SRP med SRP-bogen.

Indhold

Abstract 1
Indledning 4
Sygdommen malaria 4
Livscyklus 5
I mennesket 6
I myggen 7
Primære og sekundære metabolitter 8
Behandling mod infektion af P. falciparum 9
Quinin 9
Proguanil 10
Atovaquone 11
Hvorfor er malaria ikke udryddet endnu? 12
Malaria er et fattigdomsproblem 13
En vaccine mod PAM 13
Udvikling af en vaccine 14
VAR2CSA proteinet 16
Virkningsmekanisme 19
PAM vaccinen 19
Fremstilling af vaccinekandidaten 20
Lysis af E. coli celler 20
Oprensning af antigener 21
SDS-PAGE af antigener 22
Western blotting af antigener 24
ELISA 25
Analyse af resultater 26
SDS-PAGE af antigener 26
Western blotting af antigener 27
ELISA for bestemmelse af koncentrationen af antigener 28
Konklusion 29
Litteraturliste 31
Bilag 1: Kommentar til opgaven 33
Bilag 2: Bestemmelse af pKs for atovaquone 34
Bilag 3: De forskellige varianter af PfEMP1 35
Forsøgsvejledninger 36
Bilag 4: Forarbejde 37
Bilag 5: Lysis af E. coli-celler 40
Bilag 6: Antigenoprensning 42
Bilag 7: SDS-PAGE af antigener 44
Bilag 8: Western blotting af antigener 46
Bilag 9: ELISA 49
Bilag 10: Resultater fra ELISA forsøg 51
Bilag 11: Beregninger for ELISA forsøg 52

Uddrag

Sygdommen malaria
I år 2015 estimerede WHO, at der var 214 millioner malaria tilfælde, hvoraf 438.000 var fatale, ca. 88% af disse tilfælde findes i Afrika syd for Sahara. Sygdommen malaria skyldes en infektion af en parasitisk protezoa (encellet organisme med cellekerne) af slægten Plasmodium. Der findes fire forskellige arter af Plasmodium slægten, som kan inficere mennesker (Homo sapiens)
- Plasmodium falciparum
- Plasmodium malarie
- Plasmodium ovale
- Plasmodium vivax
...
I myggen
Den anden værtsorganisme for malariaparasitten er myg af arten Anopheles. Der findes 80 un-derarter, som kan bære sygdommen, hvoraf 45 bliver betragtet som vigtige vektorer (et insekt eller dyr, der kan sprede patogener fra en vært til den næste). Det er kun gravide hunmyg, der stikker mennesker for at skaffe blod, som indeholder protein til deres æg. Når en hunmyg stikker et menneske, som har en høj koncentration af umodne gametocytter i blodet, vil nogle af disse blive overført til myggen.
...
Proguanil
Proguanil bruges enten som profylakse sammen med chloroquin (lægemidlet paludrine) eller som enten profylakse eller behandling for sammen med atovaquone (lægemidlet malarone).
Når man indtager proguanil (se Figur 4 a) bliver det omdannet til den aktive metabolit cycloguanil (se Figur 4 b). Cycloguanil angriber P. falciparum i stadierne før det erythrocytære stadie, som quinin og chloroquin angriber. Stoffet er en antimetabolit, og angriber parasitten ved at blokere en proces i parasittens naturlige stofskifte. Dette sker i praksis ved, at cycloguanil binder til enzy-met DHFR (dihydrofolat reductase) som omdanner dihydrofolsyre til tetrahydrofolsyre, også kaldet folinisyre (et B-vitamin).
...
Hvorfor er malaria ikke udryddet endnu?
Man har siden begyndelsen af 1500-tallet kendt til, at barken fra kinatræet, som indeholder quinin og flere forskellige quininanaloger, er et virkningsfuldt lægemiddel mod malaria. Det er også fra herfra, at man i 1820 første gang isolerede lægemidlet quinin. Men hvorfor er det så, at vi ikke for længst har udryddet malaria?
En af årsagerne er, at alle de medikamentelle profylaktiske midler mod malaria ikke er 100 % effektive, eftersom P. falciparum har udviklet resistens overfor paludrine, og malarone giver kun 95 % beskyttelse.
...
En vaccine mod PAM
En anden metode til at bekæmpe malaria er ved at udvikle en vaccine, så kroppens eget immun-forsvar kan bekæmpe parasitten uden at have været inficeret før. Dette kan man gøre ved at lave en vaccine med et protein, som man ved, at parasitten udtrykker. For P. falciparum ved man, at den vil danne en proteinbro for at undgå at blive udskilt i milten. Udfordringen ved denne metode er at P. falciparum har 60 forskellige udgaver af proteinet PfEMP1 (Plasmodium falciparum eryt-hrocyte membrane protein 1) (se Bilag 3), som danner proteinbroen. Man kan derfor ikke lave en vaccine, der indeholder alle varianterne. PfEMP1 danner proteinbroen ved at binde til nogle alle-stedsnærværende receptorer i endothelvævet, hvor den mest almindelige receptor er CD36.
...
VAR2CSA proteinet
Den primære struktur af et protein, er aminosyresekvensen (rækkefølgen af aminosyrer), i det pågældende protein. Der findes 20 forskellige aminosyrer, som alle dannes ud fra den samme grundstruktur (se figur 6). Denne struktur indeholder et C-atom, som er bundet til en primær amin (se Figur 6 blå ring), en carboxylsyre (se Figur 6 rød ring), et H-atom, og en sidekæde (R-gruppen), som er forskellig for alle aminosyrerne. Da C-atomet er bundet til fire forskellige grupper, er C-atomet chiralt (undtagen for glycin, hvor sidekæden er et hydrogenatom).
...
Virkningsmekanisme
Når et individ første gang bliver inficeret med et patogen, så vil der være relativt få B-celler, hvis antistoffer kan genkende dele af antigenerne på patogenets overflade (se Figur 9, 2). I dette til-fælde er det antigenet VAR2CSA, som udtrykkes på overfladen af inficerede erythrocytter. De B-celler der genkender en del af VAR2CSA, vil blive aktiveret, og dermed begynde at dele sig til klo-ner af kortlivede plasmaceller (se Figur 9, 3). Disse plasmaceller vil begynde at producere de anti-stoffer, som genkendte en del af antigenet, og derefter frigive dem til blodet. I blodet vil koncen-trationen af antistoffer stige, og antistofferne vil binde til VAR2CSA udtrykt på erythrocyttens over-flade (se Figur 9, 4).
...
Fremstilling af vaccinekandidaten
Lysis af E. coli celler
Det rekombinante antigen mod VAR2CSA er blevet indsat i E. coli celler. Derefter har E. coli cel-lerne produceret en mængde af antigenet, som stadig befinder sig inde i cellerne. Første trin i oprensningen er derfor at få antigenet ud af cellen. Dette kan gøres enzymatisk, mekanisk eller som i dette forsøg via sonikation (lydbølger). For at få proteinerne ud af cellen foretages en lysis af bakteriecellerne. Lysis er en opløsning af celler (af græsk lyein (løse, opløse)), som foregår ved at nedbryde cellemembranen. Bakterieceller har en forholdsvis stiv cellevæg, på grund af et højt osmotisk tryk, som skyldes en høj koncentration af salte i cellens cytoplasma. Derfor vil en øde-læggelse af cellevæggen føre til en sprængning af cellen.
...
Western blotting af antigener
En metode til at påvise tilstedeværelsen af det ønskede antigen, er at lave en western blotting af gelen fra gelelektroforesen. Der benyttes samme fremgangsmåde som ved SDS-PAGE af antigener til at køre en gelelektroforese af prøverne. Efter man har kørt gelelektroforesen, overfører man ved et westernblot proteinerne til en nitrocellulosemembran. Når proteinerne er overført til membranen bruges en metode, som ligner kvalitativ ELISA. Membranen ligges i en opløsning, som indeholder antistoffer, som er specifikke for det antigen, som man forsøger at oprense. De vil der-for kun binde til det specifikke protein, hvis det er tilstede, og hvis det ikke er, vil de ikke binde sig. Derefter vaskes der med demineraliseret vand for at vaske overskydende antistoffer væk. Efter-følgende ligges membranen i en opløsning med sekundært antistof som er bundet til et enzym, der udvikler en farve når et bestemt substrat tilsættes
...
Analyse af resultater
SDS-PAGE af antigener
Resultatet fra gelelektroforesen kan ses i figur 14. Her kan man se at der i prøve 1, er mange pro-teiner tilstede, med mange forskellige størrelser, man kan ikke skille et ud fra de andre. I prøve 2, hvor det kun er supernatanten, efter en centrifugering, som er udtaget, bliver mange af disse pro-teiner sorteret fra. I prøve 3 efter filtreringen, kan man ikke se så stor forskel, hvilket nok skyldes at de proteiner, som ville være for store til at kunne komme igennem filtret, var nogle af de prote-iner, som bundfældede under centrifugeringen.
...
ELISA for bestemmelse af koncentrationen af antigener
Derefter udførtes en kvantitativ ELISA, for at bestemme koncentration af prøven med de oprense-de antigener. Resultatet kan ses i figur 16. Resultaterne fra aflæsningen af absorbansen med spek-trofotometer kan ses i Bilag 10. Da der ikke er sket nogen farve reaktion i de negative kontroller, og der er sket en farvereaktion i alle de positive kontroller, ved man at der ikke er sket nogle store fejl. Der er dog en brønd der afviger i farven (se Figur 16, sort ring). Dette kan skyldes at der er kommet luftbobler i brønden, da der er blevet tilsat enten primært eller sekundært antistof, som derfor ikke har bundet til ligeså mange proteiner, som i de andre brønde.
... Køb adgang for at læse mere

SRP om placental associeret malaria (PAM) | Kemi A og Bioteknologi A

[0]
Der er endnu ingen bedømmelser af dette produkt.

Materialer relateret til SRP om placental associeret malaria (PAM) | Kemi A og Bioteknologi A.