Produktion og oprensning af β-galactosidase

Uddrag

Indledning
Formålet er at oprense β-galactosidase.

Princippet i oprensning og produktion af β-galactosidase:
Til hver prøve skal vi høste celler fra to fermenteringskulturer.

Princippet for cellehøst er at vi centrifugere vores fermenteringskulturer, for at rense dem for dyrkningsmiddel, før vi skal åbne cellerne.

Cellerne åbnes ved hjælp af sonikering under køling.

For udsaltning tilsættes ammoniumsulfat med 60 % mætning, for primært at fjerne vandet fra proteinerne. De fleste proteiner er opløselige i vand, men så snart der tilsættes den rette koncentration af salt, vil saltet og vandet binde sig til hinanden, og proteinerne vil udfældes. Sekundært er udsaltning også en form for grovsortering af proteiner.

Ved Gelfiltrering adskilles molekylerne efter molekylestørrelse ved hjælp af en Bio-Rad kolonne med søjlematerialet Sephadex, som er koblet på en UV-monitor og en skriver. Når prøven påsættes kolonnen, vil de små molekyler (saltet) i søjlen trænge ind i gelmaterialet og blive forsinket. Hvorimod proteiner er for store til at trænge ind, og vil løbe lige igennem. Dermed bliver saltet altså fjernet fra proteinopløsningen.

Ved ionbytning adskilles proteinerne efter ladning ved hjælp af en anionbytter, en UV-monitor, en fraktionsopsamler og en skriver. β-galactosidase har en pI = 4,7, og når pH er på 6,1, vil opløsningen blive negativt ladet. Da søjlematerialet er positivt ladet vil β-galactosidase først og fremmest sætte sig fast på kolonnen, og de positivt ladet proteiner vil løbe igennem. Så snart der tilsættes 1M NaCl, vil Cl-ionerne optage alle pladserne med positiv ladning, og β-galactosidase vil her løbe ud af kolonnen... Køb adgang for at læse mere Allerede medlem? Log ind